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    微生态制剂对奶牛子宫内膜炎的治疗效果


    摘 要:对泰安地区一例奶牛子宫内膜炎病牛子宫分泌物内的病原菌进行了分离鉴定,共分离出菌株49株,其中主要病原菌为大肠杆菌和巴氏葡萄球菌。采用微生态制剂对病原菌进行了体外抑菌试验,以体外试验结果作为指导,在牧场进行了疗效试验。结果表明,微生态制剂对奶牛子宫内膜炎有效率95%19/20),治愈率 75%15/20),说明微生态制剂可作为奶牛子宫内膜炎治疗药物使用,为解决生产中奶牛子宫内膜炎高发、奶中抗生素残留的难题提供了新途径。

    关键词:子宫内膜炎;微生态制剂;疗效;奶牛

    子宫内膜炎是奶牛常见的产科疾病,发病率高达20%40%,占不孕症70%左右。奶?;甲庸谀ぱ资故芫巡荒茏糯不蚺咛ピ缙谒劳?,延长了产犊间隔,严重影响奶牛的繁殖力和生产性能,降低奶牛养殖的经济效益,阻碍了奶牛业的发展(才让太,2013)。

    子宫内膜炎是奶牛产后由于细菌感染而引起的常见产科疾病,奶牛生殖道内微生态平衡被破坏,采用抗生素及化学药物治疗,常导致刺激子宫黏膜、出现抗药性及污染牛奶等问题,给奶牛业带来很大危害。国外已经用乳酸杆菌、双歧杆菌等制成悬剂来治疗奶牛子宫内膜炎,且取得了良好的效果。随着人们对绿色食品的关注,利用微生态制剂治疗奶牛子宫内膜炎已成为一种发展趋势(李炳志等,2008)。

       本试验对一例患子宫内膜炎的奶牛生殖道病原菌进行分离鉴定,然后采用微生态制剂对病原菌进行体外抑菌试验,以体外试验结果作为指导,在牧场进行疗效试验。以微生态制剂作为奶牛子宫内膜炎的防治措施,可有效减少抗生素的使用及药物残留,为微生态制剂临床治疗母畜子宫内膜炎提供试验依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    微生态制剂:主要成分为乳酸菌发酵离心上清液,其主要成分为乳酸菌代谢产物,产品中没有活菌。样品由山东宝来利来生物工程股份有限公司提供。

    1.2 试验方法

    1.2.1 病原菌的分离鉴定

    1.2.1.1 病原菌的采集

       采样对象:泰安市周边某牧场一头患有子宫内膜炎和生殖道疾病的奶牛。

    采样方法:用清水冲洗奶牛阴道外阴部,用95%酒精对奶牛阴道口进行擦拭消毒,避

    免外部污染。把奶牛肠道内粪便掏干净,用直肠法找到子宫颈,用输精器将一次性输精套管送到子宫颈口处,拔出输精管,用注射器通过一次性输精管吸出奶牛子宫内分泌物,迅速放入已灭菌10 mL离心管并低温保存。

    1.2.1.2  病原菌的分离鉴定

    培养基:脑心浸液琼脂培养基、绵羊血琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基(EMS)、SS 琼脂培养基,均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

    把采集到的病样分别在上述培养基上按照常规菌种分离方法划线,37 ℃静止培养24 h。 后挑取平皿上不同菌落进行初步分离与纯化培养,以便分离到纯单菌落。根据菌落形态、革兰氏染色特性等初步对细菌进行分类,然后挑取典型单菌落通过选择性培养基进行进一步细分纯化并做镜检,将纯化好的菌种用脑心浸液肉汤(BHI)培养基进行液体培养,离心,取菌泥用细菌DNA提取试剂盒提取各菌株菌体DNA,并对其进行16SrDNA 序列扩增。 PCR 扩增引物:1492r5-ggttaccttgttacgactt-327f 5-agagttgatcctggctcag-3'。PCR反应体系(50 μL)为:Mixture 25 μL(含Taq DNA 聚合酶及dNTP等,天根生化科技有限公,PCR产物测序由博尚生物技术有限公司完,要求双向测通。将拼接后的序列结果输入www.NCBI.nlm.nih.gov/blast,与GenBank数据库中的序列进行同源性比对(武香玉等,2012)。

    1.2.2  微生态制剂对奶牛生殖道病原菌的体外拮抗试验

    1.2.2.1 病原菌的制备

    分离到的奶牛子宫内膜炎病原菌分别接种于脑心浸液肉汤培养基,培养24 h后取出,4 ℃冰箱保存备用。

    1.2.2.2  微生态制剂对病原菌的体外拮抗试验

    (管蝶法)

       培养基:(1)上层培养基:脑心浸液肉汤培养基、琼脂 8 g、蒸馏水1 000 mL,pH

    自然。

    2)底层培养基:脑心浸液肉汤培养基、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL,pH值自然。

    方法:在直径9 cm培养皿中加人15 mL灭菌底层培养基,平放,待冷却凝固后,用移液枪分别吸取0.1 mL指示菌发酵液于装有约50 mL、45 ℃上层培养基的三角瓶中,摇匀。 然后迅速取5 mL加到底层培养基上,摇匀平放,使之冷却凝固。在上述每个平皿内等距离放置5~6 个牛津杯,其中3个牛津杯中各加入280 μL微生态制剂溶液,其余牛津杯中各加入280 μL生理盐水作为对照。盖上陶瓦盖,于30 ℃培养16 h。观察平皿,看牛津杯周围是否有明显的抑菌圈,并测量抑菌圈直径(雷波,2006)。抑菌圈直径大小可以反映微生态制剂溶液对特定指示菌抑菌能力的大小。

    1.2.3 微生态制剂治疗奶牛子宫内膜炎的疗效试验

    1.2.3.1  试验动物

    选取患子宫内膜炎的奶牛20 头,为年龄36岁,产后15 d 以后未经治疗或在近期(至

    少一周内)未经治疗,采用微生态制剂灌注治疗。另外选5头病牛,每天一次性注入50 mL 灭菌生理盐水,连注46 d作为对照组。

    1.2.3.2  患病奶牛诊断标准

    1)产后15 d起,不定期自阴道流出浑浊或脓性分泌物;(2)子宫洗出液细菌学检查有病原菌,(3)子宫复原不全,厚薄不均,反应迟钝等。

    1.2.3.3  微生态制剂的使用方法

    每次用量100150 mL,每天1次,连续使用46 d。使用前,先用无菌的生理盐水对

    生殖道进行灌注冲洗,待冲洗液完全流出,将微生态制剂用一次性输精管灌注到奶牛生殖道内进行冲洗。

    1.2.3.4  治愈标准

    治愈:末次治疗15 d后,不再有排出物(或发情时排出正常透明分泌物),直肠检查子宫恢复正常;细菌检验一般子宫内无病原菌。

    好转:排出物由脓性变为浑浊半透明、分泌 物量较少;子宫基本恢复正常。

    无效:治疗前后子宫炎症无变化。

    治愈率(% = 治愈奶牛头数/试验奶牛总头数×100%

    有效率(% =( 治愈奶牛头数 + 好转奶牛头数)/试验奶牛总头数×100%

    2  试验结果

    2.1  奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定

    试验共分离到细菌49株,经测序比对,主要为大肠杆菌(71.25%)和巴士葡萄球菌(28.75%)。

    2.2  微生态制剂对奶牛生殖道病原菌的体外拮抗

    试验

    试验结果显示,微生态制剂对奶牛大肠杆菌、巴氏葡萄球菌均具有良好的抑制作用(图 1-2)。


    1 微生态制剂对牛大肠杆菌的抑制效果                         图2 微生态制剂对巴氏葡萄球菌的抑制效果

    注:1、4、5:微生态制剂;2、3、6:生理盐水              注:2、3、5:微生态制剂;1、4:生理盐水

    2.3微生态制剂治疗奶牛子宫内膜炎的疗效试验

    2.3.1临床观察

       微生态制剂注入生殖道后,在最初56 d 子宫排出物略为增多,呈黏液性或脓性混杂物,一周后分泌物明显减少,15 d后不再有排出物。

    2.3.2 治疗结果

       试验结果证实,微生态制剂治疗的20头病牛中,一个疗程中治愈15头,好转4头,治愈率75%,一个疗程中有效率为95%;而对照组5头牛中4头仍有脓性分泌物排出,5 头奶牛子宫内容物中都分离出病原菌。

    2.4  治愈后的受胎情况

       治愈后的20头奶牛,愈后第一个发情期有12头牛配种怀孕,其余牛只在第二个发情期也都能配种受胎。

    3  讨论

    3.1 健康奶牛子宫是无菌的,其子宫内一旦感染病原菌,就会导致子宫内膜炎发生。本试验从一例患子宫内膜炎奶牛中分离到了巴氏葡萄球菌和大肠杆菌,说明这两种菌就是导致该奶牛子宫内膜炎的病原菌。

    3.2 对奶牛生殖道病原菌的体外抑菌试验结果证实,本微生态制剂可以很好地抑制奶牛生殖道常见病原菌巴氏葡萄球菌、牛大肠杆菌的生长,初步说明微生态制剂可以用于奶牛生殖道炎症的治疗。

    3.3 传统奶牛子宫内膜炎治疗一般采用抗生素,但是抗生素在牛奶中的残留问题大大限制了抗生素在临床上的应用?;诖?,作为抗生素替代品之一的微生态制剂在奶牛子宫内膜炎防治中引起了研究者的重视。王世荣(1991)用一株乳酸杆菌做成生物制剂,并在济南、北京、青岛等地对母牛子宫内膜炎和阴道炎进行了治疗试验,共治疗慢性母牛子宫内膜炎480头, 治愈384头,好转52头,治愈率80%,总有效率90.8%。徐耀基(1998)利用从健康母猪生殖道分离出的一株粪链球菌,经培养制成微生态制剂治疗患子宫内膜炎的奶牛,一个疗程治愈率为80%,有效率为100%。本试验在利用微生态制剂体外抑制病原菌试验效果良好的基础上,将其应用到奶牛子宫内膜炎治疗中,共治疗20头病牛,治愈率达75%,说明微生态制剂具有较好的治疗奶牛子宫内膜炎的效果。

    3.4  用于治疗奶牛子宫内膜炎的微生态制剂,如阴道杆菌、乳酸杆菌都能利用黏膜上皮的糖原分解为乳酸,以抑制阴道中其他微生物生长(徐耀基等,1998)。本试验中所用微生态制剂为乳酸菌发酵上清液,其中含有大量乳酸、促上皮生长因子等代谢产物,可以有效地抑制或杀灭患子宫内膜炎奶牛子宫内病原菌,同时修复奶牛生殖道黏膜损伤,增强黏膜免疫屏障功能,因此对奶牛子宫内膜炎有一定治疗作用。

    4结论

       利用微生态制剂灌注治疗奶牛子宫内膜炎有显著效果。






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